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煙草含氮化合物測定

煙草含氮化合物測定

　　第一節(jié) 煙葉中氮化合物的特性及其測定意義

　　1煙草中氮素形態(tài)：

　　蛋白質(zhì) 氨基酸 酰胺 NH3 硝酸鹽 植物堿 未知氮化物

　　2煙草氮化合物分類：

　　1) 水不溶性氮：部分蛋白質(zhì)(醇溶性和脂溶性蛋白質(zhì))

　　2) 水溶性氮：除去不溶性蛋白質(zhì)，剩余氮化物都是水溶性的，其中也包括了水溶性蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)占整個含氮化合物的60%-90%，植物體中蛋白質(zhì)的含氮量為15%-17.6%，平均為16%(蛋白質(zhì)系數(shù))煙草樣品(干煙葉)中主要的含氮化合物是蛋白質(zhì)(8%)和生物堿(1.5-3.5%)，其次是游離氨基酸(0.8%)等。

　　3含氮化合物測定意義

　　含氮量高的鮮煙葉，其多酚氧化酶活性也高，烘烤時易出現(xiàn)黑糟煙

　　含氮化合物高的干煙葉，燃吸時，味苦，辛辣，刺激性強，雜氣大。

　　第二節(jié) 煙葉總氮測定

　　煙葉中總氮含量高，則其它氮化物含量往往也高，蛋白質(zhì)和煙堿也高，因此測定總氮的含量對了解煙葉氮化物的特征具有代表性。

　　一、測定方法

　　測定主要有凱氏法和杜馬法兩種。

　　杜馬法就是將煙葉燃燒，收集N2和其它氮的氧化物，所用儀器十分精密�，F(xiàn)在主要用的是凱氏法。

　　二、凱氏法定氮

　　原理：煙草中的含氮化合物用濃硫酸消煮分解，使其中各種形態(tài)的氮素全部轉(zhuǎn)化為氨，并與硫酸結(jié)合形成硫酸銨，然后加堿(NaOH)蒸餾，使硫酸銨中的NH3釋放出來，用硼酸吸收，然后用標準酸(H2SO4)滴定，計算出N含量。

　　1、煙樣消化

　　在高溫下濃硫酸是一種強氧化劑，能將有機物中的碳全部分解氧化成CO2,從而破壞了有機物的結(jié)構(gòu)，樣品中的含氮化合物，如蛋白質(zhì)，在濃硫酸的作用下，水解為氨基酸，氨基酸脫氨產(chǎn)生NH3,NH3與硫酸結(jié)合成為硫酸銨留在溶液中。

　　2、蒸餾

　　向消化液中加入過量的強堿NaOH，使(NH4)2SO4的NH3逸出，并用硼酸溶液吸收之。

　　3、滴定

　　用標準酸滴定硼酸吸收的氨，根據(jù)標準酸的用量計算出消化液中的N量。

　　這種測定總氮的方法最初是由凱德爾(Kjeldahl)1884年在研究蛋白質(zhì)中的N時發(fā)明的，所以叫凱氏定氮法。該種方法測定結(jié)果準確可靠，但是

　　(1)消化時間過長，濃硫酸(沸點360℃)在360℃下加熱分解煙樣需5h以上。

　　(2)標準液配制麻煩。原始的凱氏定氮法中，需要配制兩種標準溶液(H2SO4和NaOH)。因為最初是用H2SO4吸收蒸餾出來的NH3,然后用NaOH滴定多余的H2SO4。

　　2凱氏法的改進

　　縮短消化時間

　　A 加入增溫劑K2SO4或Na2SO4 K2SO4可以提高消化液的沸點，加速有機物質(zhì)分解。K2SO4可以將消化液的沸點升高到400℃以上，但是一般應(yīng)控制在360-400℃之間，如果加入K2SO4量過多，則會使沸點溫度超過400℃，使生成的硫酸銨也會被分解釋放出氨。一般每毫升硫酸加入0.5K2SO4即可。Na2SO4的作用與K2SO4相同，但效果稍差。

　　B 加入催化劑CuSO4 起催化作用的試劑還有有Hg HgO Se FeSO4 NiSO4 從催化效率看硒>汞>銅，但是汞和硒都有毒，不常使用。CuSO4是目前廣泛使用的催化劑。

　　催化劑和增溫劑混合同時使用效果更好，CuSO4 ：K2SO4=1：10

　　C 加入氧化劑 H2O2 HClO4 K2CrO7 氧化劑主要是提高消化液中的氧氣，使供氧充足，大大縮短了消化時間。HClO4和 K2CrO7作氧化劑，可以將消化時間縮短到30-60min，但是K2CrO7會引入K離子，不能一液多用測定煙樣中的K含量。HClO4不穩(wěn)定。

　　1) 蒸餾方法改進

　　a改全部蒸餾為部分蒸餾

　　b承接流出液由硫酸改為硼酸

　　NH3和硼酸沒有起化學(xué)反應(yīng)，而是吸附在硼酸分子上。

　　2) 滴定方法改進

　　由用標準NaOH滴定H2SO4,改為用H2SO4滴定硼酸吸附的NH3。

　　3) 消化工具改進

　　改進前：凱氏瓶 電爐

　　改進后：消化管 紅外線消煮爐

　　每批可以作40個樣品。

　　改進后形成了許多不同的方法，主要以消化時所加的試劑不同命名：

　　1. H2SO4-H2O2法 穩(wěn)定，N不損失，2-3h

　　2. H2SO4-K2SO4法 穩(wěn)定，時間長，不可測K

　　3. H2SO4-K2SO4-CuSO4法穩(wěn)定，時間長，不可測K

　　4. H2SO4-HClO4法 時間短，不穩(wěn)定，N易損失

　　5. H2SO4-K2CrO4法 時間短不穩(wěn)定N易損失 不測K

　　三、H2SO4-H2O2消化法測煙草總氮

　　1原理 用強氧化劑高溫消煮煙草樣品，將其中的有機物質(zhì)氧化成CO2,各種形態(tài)的氮素全部轉(zhuǎn)化為氨，并與硫酸結(jié)合形成硫酸銨，然后用堿(NaOH)蒸餾，使硫酸銨中的NH3釋放出來，并用硼酸吸收，最后用標準酸(H2SO4)滴定硼酸吸附的NH3，并計算出樣品N含量。

　　2步驟

　　1) 消化

　　0.2g樣品于消化管中，加6mL濃硫酸，放置過夜(也可直接消化)―――于消煮爐上先低溫慢加熱至開始冒出大量白煙，待白煙減少時，取出稍冷卻，逐滴加入30%H2O2 10D，充分振蕩―――繼續(xù)放于消煮爐上加熱，再冒白煙，再沸騰，待白煙再減少時，取出稍冷卻，逐滴加入30%H2O2 8D 充分振蕩―――再繼續(xù)消煮，每次待白煙減少時滴加的H2O2量都比前次減少2D，直至最后溶液澄清無色。最后一次滴加H2O2后應(yīng)繼續(xù)加熱沸騰5-10min，以除盡H2O2。

　　在消煮的同時作2份空白試驗：可以用葡萄糖代替煙樣，也可以不用葡萄糖，直接將6mL濃硫酸進行消化。

　　消化液冷卻，加水稀釋后定容100mL

　　消化液顏色變化：黑色――醬油色――紅宗色――黃色―――無色

　　2) 蒸餾

　　從100mL待測液中取10mL于半微量凱氏定氮整流器中，加5mL40%NaOH溶液蒸餾。流出液用加有2D溴鉀酚綠-甲基紅指示劑的2%硼酸5mL吸收。指示劑顏色變化：紅紫色――蘭紫色

　　3) 滴定

　　用已知濃度的標準酸0.01mol/LH2SO4滴定流出液中被硼酸吸附的NH3, 溶液顏色變化：蘭紫色――微紅色，根據(jù)標準酸的用量計算出煙葉總氮含量。

　　四、擴散皿法測煙葉總氮

　　1原理同消煮法

　　2待測液制備同消煮法

　　3用擴散法代替蒸餾法將待測液中硫酸銨中的NH3擴散進入硼酸溶液中，然后用標準酸滴定硼酸溶液中吸附的NH3。

　　擴散皿的內(nèi)室(低)裝入2mL硼酸溶液，外室(高)加入1mL待測液蓋上毛玻璃，邊緣涂上堿性甘油密封后，從小空向外室注入1mL 40%NaOH溶液，立即密封。在25-30℃擴散24h。擴散溫度不易超過30℃，否則擴散皿會破裂。

　　第三節(jié)、煙草中蛋白質(zhì)測定

　　一、間接法 ：通過測定樣品中蛋白質(zhì)的含氮量來推算蛋白質(zhì)的含量的方法。

　　1間接計算法

　　粗蛋白質(zhì)%=(總N%-煙堿%*0.1728)*6.25

　　2間接測定法

　　1) 原理：先把蛋白質(zhì)從煙樣中分離出來，然后對含蛋白質(zhì)的沉淀進行消化，蒸餾和滴定，測出蛋白質(zhì)中總氮含量，然后根據(jù)蛋白質(zhì)系數(shù)6.25換算出蛋白質(zhì)含量。

　　2)步驟

　　2g樣品于燒杯中，加入50mL沸水，6%CuSO4 和NaOH各25mL――加熱攪拌15min，放置1h――過濾，蛋白質(zhì)形成的沉淀留在殘渣中，慮液中是水溶性氮化物。這就將蛋白質(zhì)和水溶性氮化物分開了――取下帶慮渣的漏斗60℃稍烘干―――濾紙帶殘渣一并放入消煮管內(nèi)消化，蒸餾，滴定，測定出蛋白質(zhì)含氮量，并計算出蛋白質(zhì)的量。

　　蛋白質(zhì)%=蛋白質(zhì)N%*6.25

　　二、直接法：根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)如，對紫外光的吸收，雙縮尿反應(yīng)等測定蛋白質(zhì)的含量。

　　鮮組織中蛋白質(zhì)的測定最常用的是考馬斯亮藍法，該法用牛血清蛋白作工作曲線牛血清蛋白需在低溫冰箱中保存。

　　第四節(jié)水溶性總氮的測定

　　煙葉總的氮化物包括：1可溶性氮2不可溶性氮

　　間接測定法測定蛋白質(zhì)時，將煙葉總的氮化物分為兩部分：

　　1蛋白質(zhì)

　　2除去蛋白質(zhì)外的水溶性氮化物

　　水溶性總氮包括::氨態(tài)氮，酰胺態(tài)氮，氨基態(tài)氮

　　因此將除去蛋白質(zhì)的水溶液消化后,按照凱氏法測定其中的氮含量,就是水溶性總氮.

　　(一)酰胺態(tài)氮的測定

　　1、原理：酰胺化合物在酸性或堿性條件下都易于分解產(chǎn)生NH3

　　(二)自由態(tài)氮的測定

　　原理：自由態(tài)氮易揮發(fā)，如果在強堿介質(zhì)中蒸餾，其他形式的氮也被蒸餾出來，因此在緩沖溶液中并且低溫低壓條件下，直接蒸餾水溶性氮待測液，測出的就是自由氨中的氮。

　　與酰胺氮測定的區(qū)別：免去3M硫酸水解，及加NaOH中和

　　(三)總植物堿氮的測定

　　煙草中主要的植物堿：

　　煙堿，降煙堿，新煙草堿，假木賊堿

　　總植物堿氮近似=煙堿×0.1728

　　(四)未知來源的氮測定

　　煙草可溶性氮化合物包括：自由氨，酰胺，煙堿，胺和其他形式未知態(tài)氮化合物。用強堿蒸餾可溶性氮液，可以將各種形式的氮化合物都蒸餾出來，除植物堿外，都是以NH3-N的形式被承接(鹽酸)吸收的。以銨鹽存在。銨鹽可以和納氏試劑顯色，在一定范圍內(nèi)顏色深淺和銨鹽量成正比。

　　未知N%=比色測得N%-自由態(tài)氨N%-酰胺態(tài)N%